Advanced Materials|使用条形码 mRNA 进行高通量体内筛选，识别具有肝外嗜向性的脂质纳米颗粒，用于原位免疫工程

对 mRNA 疫苗和治疗药物的兴趣持续增长。虽然脂质纳米颗粒（LNP）制剂对传染病免疫有效，但用于其他 mRNA 递送应用的脂质纳米颗粒（LNP）配方存在离靶点积累、免疫转染差和反应原性，限制了其在免疫工程中的应用。新 mRNA 的开发因依赖低 plex 测量而历史上通量较低，严重受限于 LNP 发现过程。我们开发了基于条形 mRNA（b-mRNA）的高通量体内 mRNA LNP 筛选平台。利用该 b-mRNA 筛选平台同时评估 122 个 LNP，我们识别出具备高效肝外转染能力的新型 LNP 制剂。我们评估了一种用于原位免疫调节的先导 LNP 候选物，在黑色素瘤同源小鼠模型中表现突出，结果显示与采用金标准 mRNA LNP 制剂治疗的小鼠相比，肿瘤负荷显著减少并延长了生存期。我们采用新型生化表征技术，以单颗粒分辨率分析纳米颗粒蛋白冠状形成，深入了解蛋白质吸附对肝脏和脾脏转染的影响。我们的研究结果共同展示了先进 LNP 筛选和表征技术在开发下一代 mRNA 免疫工程中的价值。

该研究以题为“High-Throughput In Vivo Screening Using Barcoded mRNA Identifies Lipid Nanoparticles With Extrahepatic Tropism for In Situ Immunoengineering”发表在Advanced Materials上。图1下一代条形码 mRNA 平台的开发。（a）条形码 mRNA（b-mRNA）合成流程示意图：依次通过 PCR、体外转录（IVT）和酶促加尾法合成。（b）Agilent TapeStation 电泳分析的代表性数据，显示 b-mRNA 产物的完整性和均一的尺寸分布。（c）对随机选取的 b-mRNA 进行 Sanger 测序后的序列比对标志图，显示除 12 nt 多态性条形码区域外，其余区域序列高度一致。（d）EGFP 表达的代表性直方图：转染等量 EGFP mRNA（绿色）或 EGFP b-mRNA（紫色）后，转基因表达水平无显著差异。灰色为生理盐水处理的 HeLa 细胞数据。（e）用于缩小 200 种 b-mRNA 池以避免非预期细胞相互作用产生偏差的操作流程示意图。（f）小提琴图展示各目标组织中 b-mRNA 积累的相对均一性。（g）从池缩小实验中筛选 b-mRNA 候选物的富集分析结果。富集或耗竭超过 20%（即超出阴影区）的 b-mRNA 被排除，不用于后续实验。

开发下一代mRNA疫苗和疗法，关键瓶颈在于脂质纳米颗粒（LNP）的发现速度太慢，传统方法一次只能测几个配方。宾大Michael Mitchell团队这次拿出了一套高通量筛选平台：给mRNA带上12个碱基的条形码（b-mRNA），把122种不同的LNP混合后一次性注射到小鼠体内，再通过测序看每个LNP在血液、肝、肺、脾里的不同细胞中积累了多少。用这个方法，他们筛出了好几个能高效转染肝外器官的LNP，尤其是编号112的那款——脾脏转染极强，肝脏几乎没信号。在B16-OVA黑色素瘤治疗模型中，包裹OVA抗原的LNP 112显著抑制了肿瘤生长并把中位生存期延长到31天，效果超过了临床使用的SM-102 LNP。有意思的是，他们还用单颗粒流式细胞术分析了LNP表面的蛋白冠，发现脾靶向强的LNP吸附更多ApoE，而肝靶向强的反而吸附更多β2-GPI，这挑战了“ApoE只管肝、β2-GPI只管脾”的简单认知。这套条形码筛选策略为快速发现可用于原位免疫工程的LNP提供了一个很实用的工具箱。

参考文献：