纳米材料可在纳米-生物界面调控酶的稳定性与活性，为生物催化提供多功能载体。然而，强烈的界面相互作用常会破坏酶的结构，造成酶活性大幅损失；同时，酶-纳米材料组装体的构建多依赖经验试错，难以实现理性设计。本文提出一种调控酶活性的理性策略：构建两亲性酶，使其在水相中自组装形成稳定纳米颗粒（NPs）。以4-哌啶基-1,8-萘酰亚胺功能化的葡萄糖氧化酶（PPNI–GOx）作为模型体系，系统调控戊二醛交联程度，实现对纳米颗粒尺寸与催化性能的调控。经优化得到的PPNI–GOx纳米颗粒，其催化效率与溶液中天然葡萄糖氧化酶相当，甚至更优；相较于已有文献报道的葡萄糖氧化酶纳米颗粒，催化活性提升高达66倍。将该优化后的纳米两亲酶应用于电化学葡萄糖传感器，所得传感器具备高灵敏度、宽线性范围（最高24毫摩尔/升）、低检出限（53.3微摩尔/升），且对常见干扰物具有优异的抗干扰选择性。该传感器还表现出极佳的工作稳定性，经过7天长期测试后仍可保留92%的初始响应信号。综上，本研究证实纳米两亲酶是一种高效且可调控的平台，能够提升酶活性、稳定性与传感器性能，为高性能生物催化剂和新一代生物传感体系的开发提供了具有变革意义的新策略。

该研究以题为“Nanoamphizymes: Self-Assembled Amphiphilic Enzymatic Nanomaterials for High-Performance Biocatalysis and Biosensing”发表在Advanced Functional Materials上。

图1

通过两亲性驱动自组装实现纳米两亲酶的理性设计与验证。葡萄糖氧化酶（GOx）通过与PPNI进行定点疏水偶联，转变为两亲性构筑基元，得到由亲水蛋白结构域与疏水基团构成的两亲性葡萄糖氧化酶。所得两亲性葡萄糖氧化酶在水相中自发自组装，形成纳米两亲酶。研究从多个层面对其结构与功能特性开展系统验证：利用光致发光光谱探究分子行为，通过动态光散射表征粒径分布，借助紫外-可见光谱评估催化性能，并通过电化学葡萄糖传感实验验证其实际应用潜力。

图2

PPNI–GOx与PPNI–GOx纳米颗粒的制备。PPNI–GOx包含疏水链段（PPNI）与亲水链段（GOx），二者共同促使PPNI–GOx分子在水介质中发生自组装。所得PPNI–GOx纳米颗粒具备高特异性、优异的结构稳定性以及出色的催化活性。

图2

PPNI–GOx与PPNI–GOx纳米颗粒的制备。PPNI–GOx包含疏水链段（PPNI）与亲水链段（GOx），二者共同促使PPNI–GOx分子在水介质中发生自组装。所得PPNI–GOx纳米颗粒具备高特异性、优异的结构稳定性以及出色的催化活性。

图4

(a)葡萄糖GOx–HRP–ABTS级联反应的原理示意图。(b)葡萄糖在PPNI–GOx–HRP–ABTS体系（样品I）以及PPNI–GOx纳米颗粒–HRP–ABTS体系（样品II–X）中引发的比色响应；其中PPNI–GOx纳米颗粒分别采用0毫摩尔（样品II）、0.10毫摩尔（样品III）、0.19毫摩尔（样品IV）、0.20毫摩尔（样品V）、0.21毫摩尔（样品VI）、0.22毫摩尔（样品VII）、0.23毫摩尔（样品VIII）、0.31毫摩尔（样品IX）、0.35毫摩尔（样品X）浓度的戊二醛制备。蓝绿色显色源于ABTS˙自由基阳离子的生成。GOx：葡萄糖氧化酶；HRP：辣根过氧化物酶；ABTS：2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)。Before：未添加葡萄糖；after：添加10毫摩尔葡萄糖。(c)米氏动力学曲线，(d)双倒数图，(e)样品(I)–(X)的催化效率。(f)在pH 5至9条件下，PPNI–GOx纳米颗粒（样品VI）、PPNI–GOx（样品I）与GOx纳米颗粒三者的催化效率对比。(g)在15℃至55℃温度范围内，PPNI–GOx纳米颗粒（样品VI）、PPNI–GOx（样品I）与GOx纳米颗粒三者的催化效率对比。注：(f,g)GOx纳米颗粒的信号相对较弱，因此数据放大5倍以便清晰观察。(h)PPNI–GOx纳米颗粒（样品VI）与已报道体系的催化效率对比[32-46]。图中所示误差棒代表三次独立实验的标准偏差（n = 3）。

图5

(a) 基于纳米两亲酶的丝网印刷传感电极示意图。(b) 在不同葡萄糖浓度：2毫摩尔（红色）、10毫摩尔（棕色）和24毫摩尔（黑色）条件下，PPNI–GOx纳米颗粒在不同戊二醛浓度（0–0.35毫摩尔）下的电流响应。(c) 0.65伏电压下，PPNI–GOx（红色）与PPNI–GOx纳米颗粒（黑色）在不同葡萄糖浓度（2–24毫摩尔）下的电流-时间（i–t）安培响应曲线。(d) 葡萄糖浓度与电流的校准曲线，其中红色代表PPNI–GOx，黑色代表PPNI–GOx纳米颗粒。(e) 基于PPNI–GOx纳米颗粒的葡萄糖传感器在多种干扰物质存在下的安培i–t响应：(i)葡萄糖（2毫摩尔），(ii)抗坏血酸（AsA，0.34毫摩尔），(iii)对乙酰氨基酚（APAP，1.3毫摩尔），(iv)果糖（2毫摩尔），(v)半乳糖（3.3毫摩尔），(vi)葡萄糖（2毫摩尔）。(f) 在多种干扰物存在下，基于PPNI–GOx纳米颗粒的葡萄糖传感器在葡萄糖浓度为2、10和24毫摩尔时的加标回收性能。颜色标识：黑色——未处理组；棕色——6.9×10⁻³毫摩尔溶菌酶；红色——6.9×10⁻²毫摩尔溶菌酶；绿色——1.3毫摩尔对乙酰氨基酚；蓝色——6.9×10⁻²毫摩尔溶菌酶+1.3毫摩尔对乙酰氨基酚。(g) PPNI–GOx（红色）与PPNI–GOx纳米颗粒（黑色）传感器在磷酸盐缓冲液（含2%胎牛血清）中连续7天的长期稳定性测试。(h) 第7天时PPNI–GOx纳米颗粒（黑色柱）与PPNI–GOx（红色柱）的相对电流强度。(i) PPNI–GOx（红色）与PPNI–GOx纳米颗粒（黑色）传感器在磷酸盐缓冲液中7天内的长期累积释放曲线。图中标注的误差棒代表三次独立实验的标准偏差（n = 3）。

总结

这篇 AFM 工作提出 Nanoamphizymes（纳米两亲酶），利用两亲性单元和酶实现自组装，制备酶基纳米材料。游离天然酶普遍存在稳定性弱、不易回收、环境耐受差的问题，本研究借助自组装结构对酶分子形成保护，维持蛋白构象。该材料一套体系同时实现高性能生物催化与生物传感，依靠两亲结构适配复杂生物环境，兼顾催化活性与传感信号输出。

酶固定化一直是生物催化与传感领域的热门方向。这套自组装两亲策略不用合成复杂载体，制备流程更简单。该思路可拓展到生物检测、微流控传感、生物医用探针等场景。相比传统酶固定方案，自组装策略在简化制备、保留酶活性上具备优势，后续可尝试把该体系和柔性传感、体内微环境检测结合，挖掘更多应用潜力。

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