该研究以题为“Expansion and CAR engineering of granulocyte-monocyte progenitors for cellular immunotherapy”发表在Cell上。

生物纳米前沿

工程巨噬细胞在肿瘤免疫治疗方面前景看好，但受限于体外扩增、遗传易治性及移植后生物分布。我们开发了定义的培养条件，使小鼠和人类颗粒单核细胞前体（GMPs）能够长期扩增，同时保持祖细胞身份和髓系潜力，确立了GMPs作为可再生工程平台的地位。从机制上看，我们将髓过氧化物酶识别为GMP增殖的调控因子。扩展的GMP易于工程化，转移后可播种造血生态位，产生供体衍生的骨髓生成，恢复慢性肉芽肿小鼠的抗菌防御，并产生丰富的肿瘤浸润巨噬细胞。用嵌合抗原受体（CAR）设计的GMPs抑制CD19阳性白血病和人类表皮生长因子受体2（HER2）阳性实体肿瘤。我们进一步引入了一种包含免疫球蛋白G（IgG）Fc结构域的CAR，该结构域招募宿主Fc受体表达吞噬细胞，实现主要组织相容性复合体（MHC）不匹配的T细胞引发，并提升免疫功能正常的异体癌症模型中的疗效。这些发现共同确立了可扩展的GMPs作为工程免疫治疗的可扩展平台。

图1

mGMPs的长期扩展与表征区域以蓝色标出。

图2

（A）在指定条件下培养的分选脐带血（CB）细胞（CD34CD38CD45RA）的生长曲线。细胞每3天传代一次，1×10天重新染色+++5每孔单元（48孔格式）。数据均值±三个独立实验的标准差。改良SCF/2i：SCF + GDC + TN2-30。（B） 单一hGMP在SCF/2i-IG中展开的顺序图像。在156个单独评分的hGMPs中，51个（32.7%）形成了未分化的群体。（C） 以最高细胞类型特异性基因表达评分标注的scRNA-seq序列t-SNE投影。（D） 显示scRNA-seq数据中培养时长注释的热图。富含CD34的人类CB、动员外周血（MB）和全大便细胞在SCF/2i-IG中扩增27天。（E）显示SCF/2i-IG扩展期间主要GMP身份的单元类型特征浓缩雷达图。（F）通过免疫荧光和流式细胞术评估CD68和CD14的扩展hGMPs的巨噬细胞分化。流式细胞术数据为三个独立实验的平均值±标准差。（G） 通过Giemsa染色（上方）和流式细胞术（下）使用所示颗粒细胞标记评估扩充hGMPs的颗粒细胞分化。流式细胞术数据为三个独立实验的平均值±标准差。

图3

（A） CD19 B-ALL 异种移植模型中αCD19 CAR-hGMP治疗的实验示意图（时间线如下所示）。+（B）在指定时间点对外周血白细胞中GFP B-ALL细胞进行流式细胞术定量。+（C）针对（A）小鼠的Kaplan-Meier生存分析。（D） SKOV3-GFP细胞共培养后1小时的代表性图像（5×10）5每孔）与αHER2 CAR-RFP hGMP来源巨噬细胞（1 × 105“per well”）。2小时吞噬作用的流式细胞术定量（平均值±标准差;n = 来自三个独立实验的6个样本）。（E）携带皮下SKOV3-Fluc肿瘤的NSG小鼠体内双荧光素酶成像（5 × 106细胞;n = 4）。αHER2 CAR-Nluc hGMPs（1 × 107）于第7天静脉输注。荧光素给药后第20天拍摄了fluc图像。Nluc影像是在输注后第21天（输注后14天）给药后拍摄的。（F） 使用抗人类CD68（红色）并于指定终点处使用DAPI（蓝色）对抗染色，对（E）小鼠肿瘤、脾脏和肝脏进行免疫组化。对照图像显示未处理hGMPs的携带SKOV3 NSG小鼠染色。（G） SKOV3异种移植疗效研究中αHER2 CAR-hGMP治疗的实验示意图。（H） 接种SKOV3-Fuc细胞并用αHER2 CAR-RFP hGMPs或PBS处理的NSG小鼠肿瘤负荷随时间变化的代表性生物发光图像（1 × 107细胞;n = 每组8只小鼠）。（I）通过肿瘤区域的综合Fluc发光量化（H）肿瘤负荷。（J） （H） 小鼠的Kaplan-Meier生存分析。

图4

CAR-Fc增强异体抗肿瘤反应（A） 将IgG1 Fc结构域（及连接体）纳入CAR细胞外区域的CAR-Fc设计示意图，如所示。（B）混合株共培养示意图。工程化的BALB/c基因GMP衍生巨噬细胞与野生型（WT）C57BL/6巨噬细胞和OT-II CD4 T细胞，以及表达hHER2和OVA的Py230肿瘤细胞共同培养^+323–339肽。OT-II激活需要OVA^323–339在C57BL/6宿主吞噬细胞获得抗原后呈报于C57BL/6 MHC II类。（C）通过工程BALB/c巨噬细胞进行顺式吞噬的流式定量，以及WT C57BL/6巨噬细胞对反式吞噬作用的定量。（D）OT-II T细胞在共培养条件下增殖的代表性图像。（E）通过流式细胞术定量OT-II T细胞的CFSE稀释。（F）共培养上清液（干扰素γ[IFN-γ]和IL-2，如所示）中的细胞因子水平。（G）同基因A20传播淋巴瘤模型实验示意图，采用异体供体GMP转移（如图所示供受体株错配）。（H）通过发光法量化荧光素表达A20细胞的淋巴瘤负荷（p值：CAR与Null < 0.0001，CAR-Fc与Null < 0.0001，CAR-Fc vs. CAR = 0.008）。（I） 对（G）小鼠的Kaplan-Meier生存分析（p值：CAR与Null = 0.033，CAR-Fc与Null = 0.002，CAR-Fc vs. CAR = 0.007）。（J） 同基因hHER2 4T1肿瘤模型实验示意图，采用异基因供体GMP移植（供体-受体株差配，如注明所示）。^{+（K） 代表性肿瘤切片图像，显示第9、11和12天RFP供体GMP来源细胞的F4/80染色。+（L） 定量在第9、11和12天时RFP供体细胞中F4/80的比例。++（M）代表性肿瘤切片图像，显示CD3和Granzyme B（GZB）染色。}

参考信息

Cell(IF 45.1)

张工17715390137     陈工18914047343